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产品名称                                                 单位        货号

M5 Hiper EndoFree Plasmid Midi Kit     10T      MF112-01

【储存条件】

常温运输，室温（15~30˚C）保存。

【产品简介】

本试剂盒专门用于从15-50 ml菌液中高效、快速提取质粒。在碱裂解法裂解细胞的基础上，采用独特的硅基质膜吸附技术，高效专一的结合质粒DNA，每个吸附柱最高可吸附250 μg的质粒DNA；同时采用特殊的缓冲液系统和除内毒素过滤器，有效去除内毒素、基因组DNA、RNA、蛋白等杂质。由本试剂盒所得质粒纯度高、质量稳定，可用于细胞转染，同时也可用于DNA测序，PCR，体外转录，内切酶消化等实验。

【产品组份】

10T                                    

Buffer P1                      30 ml                     

Buffer P2                      30 ml                       

Buffer E3                      30 ml 

Buffer PS                      15 ml                   

Buffer PW (concentrate)         10 ml                   

Endo-Free Buffer EB            30 ml      

RNase A（10 mg/ml）          600 μl  

Endo-Remover FX               10

Plungers                        10

Spin Columns DX              

With Collection Tubes            10      

Centrifuge Tubes (15 ml)          10                 

【实验准备】

1．所有组分可在干燥、室温（15-30℃）环境稳定保存1年，将吸附柱置于2-8℃可保存更 长时间，加入RNase A的Buffer P1 置于2-8℃可稳定保存6个月。

2．第一次使用前，将RNase A溶液全部加入到Buffer P1中，混匀，置于2–8℃保存，使用前需在室温中放置一段时间，恢复至室温后使用。

3．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。

4．使用前请先检查Buffer P2 和Buffer E3是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀现象，可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清。

5．注意不要直接接触Buffer P2和Buffer E3，使用后应立即盖紧盖子。

6．提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。

7．使用Buffer PS处理过的吸附柱最好立即使用，避免放置时间过长影响使用效果。

【自备试剂】

无水乙醇、异丙醇

【操作步骤】

1．取15-50 ml过夜培养的菌液，加入离心管（自备）中，~5,000×g离心10分钟收集细菌，尽量吸弃全部上清。

2．向留有菌体沉淀的离心管中加入2.5 ml Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A），用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。

注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。

3．向离心管中加入2.5ml Buffer P2，温和上下颠倒混匀8-10次，使菌体充分裂解，室温放置3-5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。

注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。

4．向离心管中加入2.5ml Buffer E3，立即上下颠倒混匀8-10次，此时出现白色絮状沉淀。

注意：Buffer E3 加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。

5．安装过滤器（Endo-Remover FX）的滤帽，将步骤4所得溶液转移至过滤器中，待白色絮状沉淀浮于溶液上层，去掉过滤器的滤帽，对准干净的15 ml离心管（自备），慢慢推动推柄（Plungers）过滤，使溶液尽可能多的通过，将滤液收集在离心管中。

6．向滤液中加入1/3溶液体积的异丙醇，上下颠倒混匀。

7．柱平衡：向已装入15 ml离心管的吸附柱（Spin Columns DX）中加入1 ml Buffer PS，2500×g离心2分钟，倒掉离心管中的废液，将吸附柱重新放回离心管中。

8．将步骤6中滤液与异丙醇的混合溶液转移至已平衡的吸附柱（已装入收集管）中。

9．2500×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：吸附柱的最大容积为4 ml，所以第8步中所得溶液分2次过柱。

向吸附柱中加入2 ml Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），2500×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

重复步骤10。

将吸附柱重新放回收集管中，2500×g离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温干燥5分钟。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）

将吸附柱置于一个新的15 ml离心管中，向吸附膜的中间部位加入0.5-1 ml Endo-Free Buffer EB，室温放置2-5分钟，2500×g离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。

注意：1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，2500×g离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。

2）质粒拷贝数较低或>10 kb时，Endo-Free Buffer EB在65-70℃水浴预热，可以增加提取效率。

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。